Larry Daley (Ben Stiller) hat von seiner Ex-Frau Erica (Kim Raver – manchen aus 24 bekannt) ein Ultimatum bekommen. Sollte er es nicht schaffen eine Job zu bekommen UND ihn zu behalten, sind die Besuche bei seinem Sohn Geschichte. Nicht willens sich unterkriegen zu lassen nimmt Larry einen Job als Nachtwächter im Nationalkunde-Museum an. Dort soll er Cecil (Dick Van Dyke), Gus (Mickey Rooney) und Reginald (Bill Cobbs) – ein rüstiges Rentnertrio – ersetzen.
Die 3 scheinen auch begeistert vom Ruhestand, drücken Larry zum Abschied noch ein Handbuch in die Hand und verschwinden. Larry – nicht wirklich begeistert von seinem Job – nutzt seine Zeit aber alles andere als sinnvoll (singt über den Lautsprecher, slidet durch die Flure) und liest natürlich nicht das Handbuch. Blöde Sache, stehen dort doch die Verhaltensregeln, die er braucht wenn das Inventar des Nächtens lebendig wird. Was also tun?
