Nach den Ereignissen in „Assassin’s Creed“ ist die Lage angespannt. Abstergo (die Templer), die Desmond Miles entführt haben, wurden (Spoiler!) am Ende von Teil 1 überfallen und Desmond entdeckt, dass er ein paar der Fähigkeiten seines Ahnen Altair „geerbt“ hat. An seiner Zellenwand befinden sich seltsame Symbole. Eine Nachricht der Assassinen. Desmond wird befreit und an einen sicheren Ort gebracht. Dort wird er von Assassinen bewacht und erneut in einen weiteren Animus gesteckt.
Dieses Mal erlebt Desmond die Geschichte eines weiteren Vorfahren. Und zwar die des jungen Weiberhelden Ezio Auditore da Firenze, zur Zeit der Renaissance. Dessen Leben ist einfach, fröhlich und nur die gegnerische Familie Pazzi sorgt für ein paar Störungen. Letzten Endes passiert allerdings etwas Schlimmes: Ezios Familie wird Oopfer von Verrat Betrug. Nur wenige überleben.