Peter Parkers (Tobey Maguire) Leben ist toll. Als Spider-Man wird er von allen geliebt, er hat sein Leben mittlerweile im Griff und plant seiner Freundin Mary Jane (Kirsten Dunst), die mittlerweile am Broadway singt, einen Antrag zu machen.
Doch dann landet mittels Meteor ein außerirdischer Symbiont auf der Erde und verbindet sich mit ihm. Zudem ist Flint Marko (Thomas Haden Church), der wahre Mörder seines Onkels aus dem Gefängnis ausgebrochen und hat durch ein experimentelles Physikexperiment, sandige Superkräfte. Dann gibt es da noch Harry (James Franco), der Peter für den Tod seines Vaters verantwortlich macht. Und zu guter Letzt ist da noch Eddie Brock (Topher Grace), der Peter das Leben schwer macht (später mit Symbiont als Venom)!