Peter Parker (Andrew Garfield) ist ein typischer Nerd: dem Lernziel ist er in so gut wie jedem Fach voraus, dafür wird er ständig von der Sportskanone Flash Thompson (Chris Zylka) gehänselt und ist heimlich in seine Mitschülerin Gwen Stacy (Emma Stone) verliebt. Als Peter eines Tages eine alte Aktentasche seines Vaters wiederfindet, erwacht in ihm der Ehrgeiz, mehr über das mysteriöse Verschwinden seiner Eltern und den damit verbundenen Flugzeugabsturz herauszufinden. Sein Weg führt ihn zu Dr. Curt Connors (Rhys Ifans), einem früheren Partner seines Vaters.
Peters Einmischung bzw. Hilfe bei der Arbeit des Doktors führt schon bald dazu, dass dieser einen großen medizinischen Durchbruch erlangt. Nach einem verzweifelten Selbstversuch, da ihm wegen zu langsamen Forschungsergebnissen das Geld abgedreht werden soll, verwandelt sich Connors jedoch in eine blutrünstige Echse. Gut dass Peter auch noch ein paar Tricks auf Lager hat, denn nach dem Biss einer genetisch veränderten Spinne aus Connors Labor, entwickelt er ungeahnte Fähigkeiten die ihm die Macht geben, Böses in jeder Erscheinungsform in der Welt zu bekämpfen.
